Nel 336 a.C. Filippo venne assassinato da un ufficiale della sua guardia di nome Pausania, durante le nozze della figlia Cleopatra con il re Alessandro I d'Epiro; quest'ultimo venne immediatamente ucciso dalle guardie macedoni dopo l'assassinio del sovrano. Sembrerebbe che della congiura fossero a conoscenza, se non direttamente coinvolti, sia Olimpiade che Alessandro, venuto in contrasto con il padre a causa del suo divorzio dalla madre. Dopo questo evento Alessandro fu acclamato re di Macedonia, facendo poi eliminare tutti i possibili rivali al trono.
Consolidato il suo potere in Macedonia, egli cominciò ad espandere la propria autorità nei Balcani cominciando dai Greci. Arrivato a Larissa, egli ribadì ai tessali le proprie buone intenzioni nei loro confronti offrendosi come protettore nei confronti dei Persiani. Ad un'assemblea della Lega Tessalica, Alessandro fu eletto capo, gli venne affidata l'amministrazione delle entrate e gli fu promesso l'appoggio nella Lega Ellenica. Successivamente gli stati greci nella Lega di Corinto, eccetto Sparta, proclamarono Alessandro comandante delle loro forze contro la Persia.
Appoggiato da tutti i Greci, Alessandro avviò la campagna dei Balcani, ma alla voce della sua morte in battaglia le poleis si ribellarono, Con una marcia rapidissima di più di 200 km, Alessandro raggiunse Tebe, la circondò e la rase al suolo.
Dopodiché Alessandro volse le sue attenzioni verso l'Asia Minore. Il primo scontro si ebbe presso il fiume Granico, durante la quale Alessandro fu ferito alla testa, ma il suo esercito risultò vincitore. Dopo questa battaglia molti territori si aprirono alle sue conquiste. Città come Mileto, Efeso, Sardi si consegnarono al macedone o furono facilmente conquistate.
Mentre il grosso dell'esercito svernava in Lidia al comando di Parmenione, Alessandro passava in Licia, in Panfilia, in Pisidia e in Frigia. Qui, nell'antica capitale Gordio si svolse l'episodio del celebre nodo gordiano: pare che esistesse un antico carro il cui giogo era assicurato da un nodo inestricabile e che un oracolo avesse promesso il dominio dell'Asia a chi fosse riuscito a scioglierlo. Alessandro, dopo alcuni tentativi, risolse il problema estraendo la spada e tagliando il nodo con un colpo netto.
Nel 333 a.C. Alessandro conquistò la Siria. Dario III aveva radunato un essrcito pari a 3 volte quello macedone che aveva preso posizione nella pianura all'uscita dei passi montani delle porte siriache.
La posizione era ottimale per Alessandro, tenendo una posizione facilmente difendibile, anche quando Dario accerchiò il suo esercito.
Appena Alessandro caricò con la cavalleria leggera sull'ala sinistra, dove si trovava Dario con la sua guardia personale, il re persiano si diede alla fuga, compromettendo irrimediabilmente l'esito della battaglia (che pure stava volgendo a favore dei Persiani in altri punti). La battaglia si concluse con una completa disfatta dei Persiani e vennero presi, oltre ad un immenso bottino, anche la madre, la moglie-sorella, due figlie e un figlio di Dario. Il Grande Re perse le sue migliori truppe, quasi tutti i più validi ufficiali del suo esercito e soprattutto il proprio prestigio di condottiero, distrutto dalla sua precipitosa fuga davanti al nemico.
Successivamente Alessandro conquistò la Palestina e accolto come un liberatore in Egitto, dove maggiormente si sentiva il giogo persiano. Il macedone rispettò molto quel paese e la sua civiltà, facendo erigere templi in onore di dèi del luogo e fondò sul delta del Nilo Alessandria d'Egitto, la prima delle città a cui diede il nome.
Nella primavera del 331 a.C. Alessandro riprese la marcia verso oriente, dove Dario aveva raccolto un esercito nelle pianure dell'Assiria, nelle quali avrebbe meglio potuto sfruttare la propria superiorità numerica. L'armata macedone passò indisturbato prima l'Eufrate e quindi il Tigri. Il contatto con l'esercito di Dario avvenne il 20 settembre presso il villaggio di Gaugamela, non lontano dalle rovine di Ninive.
La battaglia fu di vitale importanza per Alessandro; il mito racconta che egli avesse solo 30000 fanti e 3000 cavalieri contro 1 milione di persiani. Per evitare di essere aggirato da un esercito tanto più numeroso del suo e disteso su un fronte lunghissimo, aveva appositamente schierato una seconda linea dietro il fronte di battaglia. La vittoria fu decisa dall'attacco della cavalleria all'ala destra, da lui stesso guidata, mentre il generale Parmenione teneva fronte sul lato opposto alla cavalleria nemica.
Dopo aver sconfitto un'ultima resistenza presso le porte persiane nelle attuali montagne dello Zagros entrò infine a Persepoli, capitale dell'impero persiano, dove venne in possesso del tesoro reale e diede alla fiamme il palazzo di Serse, vendicando così la sua invasione della Grecia.
In Grecia intanto Antipatro aveva sconfitto nella battaglia di Megalopoli (autunno del 331 a.C.) il re spartano Agide, eliminando definitivamente l'ultima opposizione delle città greche al dominio macedone.
Nel 330 a.C. Alessandro marciò su Ecbàtana, costringendo alla fuga il re Dario che vi aveva passato l'inverno. Questi, durante la fuga, fu deposto dal satrapo della Bactriana, Besso, membro della famiglia reale achemenide che successivamente lo fece uccidere al sopraggiungere di Alessandro. Questi riportò indietro il cadavere del re persiano che fece seppellire con tutti gli onori nelle tombe reali.
Ad Ecbàtana, Alessandro congedò i contingenti delle città greche. Il compito di vendicare l'invasione della Grecia da parte di Serse era ormai concluso.
Fece inoltre punire il satrapo Besso per aver ucciso Dario.
Il proposito di Alessandro di unificare in un solo popolo Macedoni e Persiani, e soprattutto la sua idea del carattere divino della monarchia, cominciarono ad alienargli le simpatie del suo seguito. L'opposizione si manifestò soprattutto quando decise di imporre il cerimoniale della proskynesis, proprio della corte persiana, anche ai suoi sudditi occidentali: la cerimonia prevedeva che chiunque comparisse davanti al re si prosternasse davanti a lui per poi rialzarsi e riceverne il bacio, e ciò andava contro all'idea greca di omaggio accettabile da parte di un uomo libero ad un altro uomo. Alessandro dovette comunque abbandonare il tentativo di introdurre tale pratica (che comunque non aveva reso obbligatoria), dato che quasi tutti i Greci e i Macedoni si rifiutavano di eseguirla.
Dopo aver preparato un nuovo esercito con truppe in gran parte asiatiche (solo gli ufficiali e i comandanti erano tutti greci o macedoni), nella primavera del 326 a.C. Alessandro marciò verso l'odierna Kabul, dove venne accolto come alleato dal re di Tassila e, attraversata l'Uddyana da Ora a Bazira (attuali Udegram e Barikot), giunse all'Indo nell'estate del 326 a.C.. Sconfisse quindi nella battaglia dell'Idaspe il re Poro (Purushotthama o Paurava) che cadde prigioniero. Il re macedone fondò quindi le colonie di Nicea e di Bucefala.
Alessandro aveva forse intenzione di arrivare fino alla vallata del Gange, ma l'armata, giunta sul fiume Ifasi (oggi Beas) e stanca delle lunghe piogge tropicali, si rifiutò di seguirlo oltre verso est.
Nel 324 a.C. il re con l'esercito riunito fece ritorno a Susa. Qui scoprì la cattiva amministrazione dei molti satrapi da lui un tempo "graziati" e comandanti. Il re procedette energicamente contro i colpevoli e sostituì molti satrapi locali con governatori macedoni. Per perseguire l'unione tra Greci e Persiani spinse ottanta alti ufficiali macedoni alle nozze con nobili persiane e altri diecimila veterani si sposarono con donne della regione.
Nella primavera del 323 a.C. Alessandro condusse una spedizione contro il popolo montanaro dei Cossei ed inviò una spedizione per esplorare le coste del Mar Caspio. Intanto preparava una spedizione che egli stesso avrebbe guidato per conquistare e circumnavigare l'Arabia. Una misteriosa malattia lo colse tuttavia durante i preparativi, portandolo alla morte il 10 giugno del 323 a.C., al tramonto. Così morì Alessandro, a quasi trentatré anni, nel tredicesimo anno del suo regno.
Sulle cause della sua morte sono state proposte varie teorie, che includono l'avvelenamento da parte dei figli di Antipatro o da parte della moglie Rossane, o più probabilmente una ricaduta della malaria che aveva contratto nel 336 a.C.
Alla sua morte nessuno dei suoi figli sembravano in grado di succedergli al trono (uno in fasce e l'altro infermo di mente), i Diadochi, i suoi generali elessero come reggente uno di loro, Perdicca. Nel 322 a.C. tuttavia Perdicca si scontrò con Tolomeo, uno dei diadochi e satrapo d'Egitto, contro al quale mosse guerra, ma durante la spedizione rimase ucciso.
Successivamente i diadochi elessero come reggente Antipatro che tuttavia non fu accettato da tutti. Ne nacque una guerra civile nel corso della quale trovarono via via la morte i famigliari ancora in vita di Alessandro, tra cui i due figli, la moglie Rossane, la madre Olimpiade, la sorella Cleopatra e la sorellastra Euridice e il fratellastro Filippo.
