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Quando i suoi genitori si sposarono il 17 agosto del 1447 a Madrigal de las Altas Torres, suo padre Giovanni II era vedovo di Maria d'Aragona, figlia del re Ferdinando I d'Aragona e da lei aveva avuto un figlio, Enrico, nato nel 1425.
Quando il padre era via, sua madre, la regina Isabella, faceva dormire i bambini con lei nello stesso letto. Era un'abitudine che teneva per evitare qualsiasi dubbio di adulterio.
Nel 1454 Giovanni II morì lasciando orfani Isabella e suo fratello Alfonso, rispettivamente di 3 anni e 1 anno. La morte del marito gettò sua madre, Isabella in un profondo stato di malinconia, tanto che decise di rinchiudersi nel castello di Arévalo, dove sarebbe rimasta per 42 anni, fino alla morte.
Al trono salì il fratellastro, Enrico IV, mentre suo fratello germano Alfonso, sempre nel 1454, ricevette il titolo di Principe delle Asturie, quello dell'erede al trono.
Nel 1455 Enrico IV si sposò (in seconde nozze) con Giovanna del Portogallo, figlia del re del Portogallo Edoardo e di Eleonora d'Aragona (figlia del re d'Aragona Ferdinando I e di Eleonora d'Alburquerque). Da questa unione, nel 1462, nacque finalmente il legittimo erede al trono, una figlia: Giovanna.
Una parte di nobili della corte che già chiamava il principe delle Asturie Alfonso XII, sfruttando molto abilmente la voce che Enrico IV fosse impotente, aveva messo in giro la diceria, molto probabilmente inventata, che la figlia di Giovanna del Portogallo fosse figlia non di Enrico IV, ma di uno dei migliori amici di Enrico, Beltrán de la Cueva, che in quegli anni aveva fatto una rapida carriera alla corte castigliana e, da allora, le fazioni contrarie al re Enrico IV cominciarono a denominare la figlia Giovanna, a cui il padre aveva dato il titolo di principessa della Asturie, col soprannome Beltraneja.
Quando suo fratello Alfonso morì improvvisamente il 5 luglio del 1468 per cause sconosciute, Isabella venne designata erede al trono di Castiglia da Enrico IV in un trattato (Tratado de los Toros de Guisando) nel quale Isabella aveva accettato la clausola che avrebbe sposato il re del Portogallo Alfonso V, mentre Enrico di fatto riconosceva l'illegittimità della figlia Giovanna.
Però i pretendenti alla mano di Isabella erano due: oltre ad Alfonso V vi era il cugino di Isabella Ferdinando, unico figlio maschio nato al duca di Peñafiel, re di Navarra e re della corona d'Aragona Giovanni II dalla sua seconda moglie Giovanna Enriquez, figlia dell'ammiraglio di Castiglia, signore di Medina de Rioseco e Conte di Melgar Federico Enriquez.
Le preferenze di Isabella andavano al secondo, così il 19 ottobre 1469, senza l'approvazione del fratellastro Enrico IV, Isabella e Ferdinando si sposarono segretamente.
Irritato dal fatto che il matrimonio venne celebrato senza il suo assenso, Enrico IV diseredò Isabella e giurò pubblicamente, assieme alla moglie, che Giovanna la Beltraneja era sua figlia legittima e la proclamò erede al trono, con la Cerimonia de la Val de Lozoya, un prato vicino a Buitrago.
Questa decisione diede origine a una serie di conflitti tra coloro che sostenevano Giovanna e tra coloro che sostenevano Isabella. Alla morte improvvisa di Enrico IV si scatenò tra questi due partiti una vera e propria guerra di successione, finché Isabella il 13 dicembre 1474 fu proclamata regina di Castiglia e Ferdinando divenne re consorte con il nome di Ferdinando V di Castiglia, mentre la Beltraneja, che ugualmente reclamava la corona, era stata promessa ad Alfonso V del Portogallo.
Immediatamente, il re del Portogallo, dichiarato re di Castiglia e León dai partigiani della moglie nonostante Isabella fosse già stata incoronata regina col marito, invase la Castiglia (estate del 1475), per difendere i diritti di sua moglie; lo scontro decisivo avvenne nei pressi di Toro, la città in cui si era insediata e dove teneva la corte Giovanna la Beltraneja.
Ferdinando aveva a disposizione un misero esercito che però la moglie riuscì ad aumentare, ottenendo aiuto dai nobili, dai conventi e dalle abbazie ed il 1º marzo 1476, nella battaglia di Toro, Ferdinando, comandante dell'esercito castigliano, mise in fuga Alfonso, che vedendo i suoi sostenitori in Castiglia diminuire si ritirò in Portogallo con la moglie, scortata dal figliastro Giovanni, erede al trono del Portogallo.
La pace fu siglata ad Alcáçovas (Viana do Alentejo), il 4 settembre del 1479, dal figlio Giovanni, in quanto Alfonso V si era da tempo ritirato nel convento di Varatojo a Torres Vedras dove morì nel 1481, e alla sua morte anche Giovanna si ritirò in convento a Coimbra dove morì nel 1530.
Il trattato venne controfirmato a Toledo nel marzo del 1480 da Isabella e Ferdinando.
L'insediamento sul trono di Isabella era avvenuto il 13 dicembre 1474 (due giorni dopo la morte del fratellastro Enrico) a Segovia; Ferdinando era assente, ma al suo ritorno reclamò i suoi diritti sulla corona di Castiglia e nel 1475, con il concordato di Segovia, si decideva che Isabella poteva esercitare il suo potere regale in Castiglia ma non in Aragona mentre Ferdinando, oltre ad esercitare il potere regale in Aragona, per il contratto di Matrimonio (capitulaciones), in Castiglia poteva amministrare la giustizia congiuntamente o separatamente; le ordinanze reali venivano firmate da entrambi; le monete recavano insieme le due effigi ed i sigilli reali portavano le armi delle due casate; infine Ferdinando si occupava della politica estera.
Alla morte dello suocero Giovanni II di Aragona avvenuta il 20 gennaio 1479, il marito Ferdinando oltre che re di Sicilia divenne re di Aragona e, nello stesso anno, fu decretata l'unione de facto della Castiglia con la Corona d'Aragona, e fu applicato il contratto di matrimonio, per cui i due Stati, benché uniti, mantenevano governi separati.
A partire dal 1481 Ferdinando si occupò della conquista del regno dei Nasridi di Granada, dove Ferdinando mise in mostra le sue doti di diplomazia e di attitudini militari, già sfoggiate nella guerra civile. La guerra fu un assedio e terminò nel 1492 con la capitolazione dell'ultimo ridotto musulmano della penisola iberica; il 2 gennaio 1492 Granada si arrese, dopo sei mesi di assedio, e Isabella vi entrò vittoriosa con il crocifisso in mano (come spesso viene rappresentata), completando così la Reconquista. La conquista di Granada riuscì a eliminare le contestazioni interne e fece guadagnare prestigio ai regni di Castiglia e Aragona agli occhi dei regni cristiani. Il regno di Granada fu unificato al regno di Castiglia, dando origine allo Stato Moderno nel 1492, quando i governi vennero congiunti. Insieme ai territori della penisola i Re Cattolici possedevano le Baleari, la Sicilia e la Sardegna.
Per sottrarre il nuovo regno al feudalesimo arcaico che ancora vi dominava e consolidare la monarchia nel senso assolutista (che già aveva mostrato la propria forza in Francia con Filippo il Bello e poi con i Valois), i nuovi sovrani provvidero a riformare i rapporti con la nobiltà e il clero; lo strumento principale e più innovativo a questo scopo furono le Cortes, sorta di parlamenti nei quali erano rappresentati i nobili, il clero ed alcune città, che potevano proporre ai sovrani nuove leggi - la cui approvazione rimaneva comunque esclusivo diritto reale.
Ma lo strumento principale di consolidamento del nuovo regno fu la religione cattolica, di cui i nuovi re di Castiglia e Aragona ben conoscevano la forza di coesione e la potenza di instrumentum regni: nonostante le resistenze del papato, l'Inquisizione e il clero furono posti dal 1478 sotto la giurisdizione reale (si evitava così che gran parte delle rendite del clero finissero a Roma e le si tratteneva a Toledo, la capitale del regno.
Nel 1480, Isabella introdusse in Castiglia l'Inquisizione e quattro anni dopo Ferdinando la introdusse anche in Aragona.
Inoltre Ferdinando stabilì il principio della conformità religiosa, per cui fu decretata (decreto di espulsione degli Ebrei del 31 marzo del 1492) l'espulsione di tutti gli Ebrei che non accettavano di convertirsi al cristianesimo o salvo battesimo (salvo bautismo) e la conversione forzosa degli abitanti del regno di Granada, nel 1503, ai quali però la regina Isabella aveva garantito il diritto alla libertà religiosa al momento della capitolazione del regno di Granada.
L'azione della "Santa" Inquisizione era diretta in particolar modo contro i Moriscos, cioè i musulmani rimasti e convertiti al cristianesimo, e soprattutto contro gli ebrei. Ciò portò alla dispersione degli ebrei sefarditi soprattutto nel bacino del Mediterraneo, in particolar modo nei territori dell'Impero Ottomano, dove trovarono una maggiore tolleranza religiosa. Molti continuavano a professare segretamente la loro religione, pur essendosi convertiti. Chi veniva scoperto era bruciato vivo sul rogo e i suoi beni erano confiscati dalla Corona, pratica che divenne piuttosto diffusa per finanziare le casse del Regno. Gli ebrei convertiti inoltre subivano in ogni caso discriminazioni sociali ed economiche: erano loro vietati particolari mestieri, venivano additati come marranos, in lingua spagnola maiali, e spesso si arrivò a segregarli in determinati quartieri-ghetto delle città, chiamati Juderias.
Alla caduta di Granada, il papa Innocenzo VIII conferì a Isabella ed al marito Ferdinando il titolo di "Maestà cattolica". In cambio, Isabella fece omaggio al successore spagnolo Alessandro VI Borgia del primo oro arrivato dalle Americhe, del quale fu rivestito il soffitto di Santa Maria Maggiore.
La disputa con il Portogallo e inizio dello sfruttamento delle colonie
Cristoforo Colombo aveva sottoposto il suo piano di circumnavigare la terra, per arrivare all'India al re del Portogallo Giovanni II, ma quest'ultimo aveva buoni motivi per ritenere che il progetto da lui seguito di doppiare l'Africa non avrebbe portato a risultati sicuri.
Colombo si rivolse così ai Re Cattolici, guadagnandosi le simpatie di Isabella che, dopo diversi anni di attesa, accettò il progetto di Colombo assieme al marito e il navigatore partì in nome di Isabella e Ferdinando. I motivi dell'appoggio erano molti: in primo luogo, il bisogno di consolidare le finanze del regno unita alla speranza di trovare nuove ricchezze nelle lontane terre di cui si cominciava a favoleggiare; inoltre, il costo per l'impresa era relativamente contenuto, e non si poteva certo correre il rischio che il navigatore genovese si rivolgesse al re di Francia Carlo VIII, che avrebbe potuto soffiare un grosso affare ai coniugi spagnoli.
La spedizione di Colombo, come si sa, ebbe fortuna e dopo la scoperta dell'America Isabella si preoccupò di sfruttarne le risorse, non senza impegnarsi a cristianizzare gli indigeni.
Ma al ritorno di Colombo dopo il primo viaggio, il re del Portogallo Giovanni II ebbe modo di incontrare l'ammiraglio genovese, approdato prima a Madera e poi a Lisbona, dove era rimasto circa dieci giorni; il re ebbe il sospetto che, secondo il trattato di Toledo del 1480, le terre scoperte fossero nella zona di influenza del Portogallo, e quindi intendeva inviare in quelle terre, appena scoperte, delle caravelle.
Ferdinando II di Aragona propose di risolvere la questione con un negoziato, ma, prima di iniziarlo, convinse papa Alessandro VI Borgia, spagnolo di nascita, a emettere una bolla (4 maggio 1493), secondo la quale tutte le terre a ovest e a sud di una linea tracciata a cento leghe dalle isole del Capo Verde alle Azzorre, sarebbero state della Spagna. Il 26 settembre, il papa emise una nuova bolla ancora più penalizzante per il Portogallo.
Giovanni II alla guerra preferì la trattativa, che portò al Trattato di Tordesillas (firmato a Tordesillas, in Castiglia, il 7 giugno 1494) che divise il mondo al di fuori dell'Europa in un duopolio esclusivo tra la Spagna ed il Portogallo. Il trattato venne ratificato dalla Spagna il 2 luglio, e dal Portogallo il 5 settembre 1494. Nella sua convinzione di dover cristianizzare il mondo, Isabella si impegnò attivamente a difesa degli Indios delle Antille che erano stati inviati come schiavi in Spagna nel 1496: diede ordine al suo inviato speciale, Francisco de Bobadilla, di riportarli in America e di destituire Colombo per alcuni suoi supposti abusi; l'ammiraglio fu arrestato, ma poi liberato con le scuse dei re cattolici.
Ricoverata a Medina del Campo (Valladolid), per un cancro all'utero, Isabella morì il 26 novembre 1504 nel palazzo reale di Medina del Campo e sul trono di Castiglia le successe la figlia terzogenita Giovanna detta la Pazza, mentre la reggenza venne rivendicata sia dal marito Filippo il Bello che dal padre Ferdinando.
Dapprima fu inumata a nella chiesa di San Francisco della Alhambra, il 18 dicembre del 1504, secondo il suo desiderio. Attualmente Isabella è sepolta nella Cappella reale di Granada, un fastoso sepolcro (che fu profanato durante l'Invasione Francese del 1800), nel centro della città, costruito dal nipote Carlo di Gand, re di Spagna con il titolo di Carlo I e in seguito Imperatore del Sacro Romano Impero, Carlo V.
Nel sepolcro si trovano anche il marito Ferdinando II di Aragona, la figlia Giovanna la Pazza con suo marito, Filippo il Bello, la figlia prediletta di Isabella, Isabella, regina del Portogallo col figlioletto Michele della Pace d'Aviz.
